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Sep 13, 2023

Première étude paléoprotéomique des otolithes de poissons fossiles et préservation à l'état pur de l'hôte cristallin biominéral

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3822 (2023) Citer cet article

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Les otolithes sont des composants de carbonate de calcium de l'organe stato-acoustique responsable de l'audition et du maintien de l'équilibre corporel chez les poissons téléostéens. Au cours de leur formation, le contrôle, par exemple, de la morphologie et du polymorphe carbonaté est influencé par des assemblages complexes de protéines de type collagène insolubles et de protéines non collagènes solubles; beaucoup de ces protéines sont incorporées dans leur structure cristalline d'aragonite. Cependant, dans les archives fossiles, ces protéines sont considérées comme perdues par les processus diagénétiques, ce qui entrave les études des mécanismes de biominéralisation passés. Nous rapportons ici la présence de 11 protéines spécifiques aux poissons (et de plusieurs isoformes) dans les otolithes de merlus phycidés du Miocène (environ 14,8–14,6 Ma). Ces otolithes fossiles ont été conservés dans des argiles imperméables à l'eau et présentent des caractéristiques microscopiques et cristallographiques indiscernables des représentants modernes, compatibles avec un état de conservation exceptionnellement vierge. En effet, ces otolithes fossiles conservent ca. 10 % des protéines séquencées à partir d'homologues modernes, y compris des protéines spécifiques au développement de l'oreille interne, telles que les protéines de type otolin-1 impliquées dans l'arrangement des otolithes dans l'épithélium sensoriel et les protéines de type otogelin/otogelin qui sont situées dans l'acellulaire membranes de l'oreille interne chez les poissons modernes. La spécificité de ces protéines exclut la possibilité d'une contamination externe. L'identification d'une fraction de protéines identiques dans les otolithes de merlus phycides modernes et fossiles implique un processus de biominéralisation de l'oreille interne hautement conservé au fil du temps.

La paléoprotéomique est un domaine de recherche en accélération qui offre de nouvelles perspectives sur, par exemple, l'évolution des processus de biominéralisation dans le temps et affine notre compréhension des restes fossiles1. Alors que les études sur l'ADN ancien sont limitées à quelques millions d'années parce que l'ADN se dégrade relativement rapidement après la mort cellulaire2, l'étude de restes de protéines plus stables dans les archives fossiles offre une opportunité d'explorer la fonction des protéines et leur évolution à des échelles de temps géologiques ; plusieurs à plusieurs centaines de millions d'années3. Les études paléoprotéomiques des biominéraux tels que les os, les dents et les coquillages sont particulièrement prometteuses car ces structures ont un potentiel élevé de préservation des résidus protéiques intégrés dans des spécimens fossiles bien conservés. Ici, nous explorons ce potentiel dans les structures fossilisées de carbonate de calcium de l'oreille interne des poissons téléostéens (otolithes). Les otolithes de poissons sont, contrairement aux restes de poissons ostéologiques, fréquemment trouvés dans les archives fossiles au cours du Mésozoïque, et avec une abondance croissante dans les strates cénozoïques4. En raison de leur morphologie spécifique au taxon, ces fossiles sont essentiels à l'interprétation de la paléobiodiversité des poissons et aux reconstructions paléoenvironnementales basées sur leurs compositions isotopiques et oligo-éléments5. Bien que les structures minérales du carbonate de calcium des otolithes puissent ressembler à des agrégats de cristaux précipités de manière inorganique, ce sont en fait des composites organiques-minéraux complexes, semblables à de nombreux autres carbonates biogéniques6. Des études sur le processus moderne de biominéralisation des otolithes ont montré que les macromolécules organiques, les protéines en particulier, contrôlent des aspects clés de la formation des otolithes7, notamment la régulation du transport du calcium, la nucléation et l'état de saturation au site de cristallisation, modulant ainsi activement la croissance des cristaux d'aragonite8. En effet, il a également été démontré que la sélection stricte d'un polymorphe spécifique de carbonate de calcium (aragonite par opposition à, par exemple, calcite ou vaterite) est contrôlée par des protéines, telles que l'acide aspartique et les résidus de sérine, qui attirent les cations calcium à la surface du cristal en croissance. et favorisent un empilement plus dense (c'est-à-dire aragonitique) d'ions9. À ce jour, plusieurs centaines de protéines ont été identifiées dans les otolithes de poissons modernes, dont beaucoup seraient directement impliquées dans la biominéralisation10. Les protéines connues pour être impliquées dans la biominéralisation des otolithes peuvent être divisées en deux groupes principaux : (1) les complexes de protéines structurelles insolubles de type collagène et (2) les protéines solubles non collagènes (PCN). Les protéines de type collagène, telles que l'otolin-1, créent un échafaudage pour le biominéral en croissance ; otolin-1 présente une homologie de séquences avec le collagène X, une protéine également impliquée dans l'ossification endochondrale et la réparation des fractures osseuses11. Les NCP solubles sont généralement des protéines hautement acides et intrinsèquement désordonnées (IDP) qui régulent directement la nucléation, l'orientation et la croissance cristalline. De tels IDP ont été identifiés dans plusieurs taxons de poissons, par exemple Starmaker (Stm) chez le poisson zèbre7, Starmaker-like (Stm-l) chez le medaka12 et Otolith Matrix Macromolecule-64 (OMM-64) chez la truite arc-en-ciel13, et leur rôle dans la biominéralisation a été soigneusement caractérisé14,15,16,17.

Trouver des preuves de protéines incrustées dans des otolithes fossiles améliorerait notre compréhension de l'évolution d'un important processus de biominéralisation aquatique, mais de tels résidus n'ont pas encore été identifiés et on pense généralement que ces composants organiques sont décomposés et perdus en raison de l'altération diagénétique de la polymorphe d'aragonite, qui est métastable et se transforme normalement en une calcite plus stable, par exemple via des processus de dissolution-précipitation en présence de solutions actives18. De tels processus diagénétiques affectent également fortement la préservation de nombreuses protéines inter/intracristallines, en particulier les NCP hautement labiles19. Afin de réussir la détection et l'identification des restes de telles protéines dans les otolithes fossiles, nous avons émis l'hypothèse que seuls les spécimens conservés dans des dépôts imperméables à l'eau et encore entièrement composés d'aragonite avec des caractéristiques ultrastructurales similaires à leurs homologues modernes, ont le potentiel de préserver les composants organiques. , très probablement sous forme d'inclusions incrustées à l'intérieur des cristaux d'aragonite. Certains fossiles d'otolithes sagittaux du Miocène de poissons téléostéens, faciles à trouver, remplissent ces critères. Nous rapportons ici les résultats d'une recherche de protéines incrustées dans des otolithes fossiles de merlus phycides trouvés dans des argiles imperméables à l'eau du Miocène (environ 14 millions d'années) exposées à Korytnica (montagnes de la Sainte Croix, Pologne centrale ; voir Matériel)20.

Otolithes sagittaux modernes (blancs) et fossiles (couleur brunâtre) de Phycis spp. sont des structures biominérales de carbonate de calcium minces et allongées ; plus large à l'avant et se rétrécissant progressivement vers les parties postérieures (Fig. 1a,h). La face interne (surface proximale) est convexe sans sulcus acusticus distinct (la zone où le tissu sensoriel entre en contact avec l'otolithe). La face externe (surface distale) est le plus souvent composée d'épaississements/protubérances irréguliers et de rainures (Fig. 1a, h). Les coupes minces longitudinales (c'est-à-dire dans le plan sagittal) observées avec la lumière transmise à la fois polarisée et normale présentent env. Unités colonnaires de 500 µm d'épaisseur qui correspondent en taille aux protubérances à la surface (Fig. 1c,j). Parfois, des vides en forme de fuseau se produisent entre les unités colonnaires qui peuvent correspondre aux rainures entre les protubérances de surface voisines (flèches blanches sur les figures 1c, j). Les unités colonnaires et les autres parties (proximales) des otolithes modernes et fossiles en coupes longitudinales présentent de nombreuses couches (alternant des zones brun foncé et incolores, d'environ 5 à 7 µm d'épaisseur ; Fig. 1c,d,j,k. Les couches sont composées de cristaux qui, dans les images d'orientation cristallographique (EBSD), sont présents avec une taille similaire dans les échantillons modernes et fossiles (Fig. 1e, l).Les cartes de phase ont confirmé la minéralogie strictement aragonitique des échantillons modernes et fossiles (Fig. 1f, m) et les figures polaires résultantes sont entièrement comparables entre les spécimens modernes (Fig. 1g) et fossiles (Fig. 1n).Un degré élevé de similitude entre les spécimens modernes et fossiles a également été observé pour la taille des cristaux, l'inclinaison, la dispersion azimutale et la distribution turbostratique dans le plan (222) (Fig. 1g,n). Les fibres d'aragonite des otolithes modernes et fossiles sont constituées d'unités minces d'environ 200 à 300 nm de large qui montrent une organisation nanogranulaire (Fig. 2a,b,g,h), avec des nanograins ca. 50 à 100 nm de diamètre clairement visible dans les images AFM en mode erreur de hauteur et de force maximale (Fig. 2c,d,i,j). Les observations TEM des lamelles squelettiques (extraites par faisceau d'ions focalisé) montrent des fibres d'aragonite à petite échelle comparables en taille à celles observées dans FESEM coupées soit obliquement (Fig. 2e) soit longitudinalement (Fig. 2k) dans le sens de la croissance. Les fibres comprennent de nombreux défauts intracristallins de faible densité (inclusions) dont la taille est comprise entre 2 et 25 nm, qui sont clairement visibles sous forme de points lumineux sur les images TEM (flèches blanches sur les figures 2f, l). Ces inclusions sont alignées perpendiculairement à la direction de croissance cristalline, comme on le voit dans les coupes longitudinales (Fig. 2f, l). Un matériau de faible densité similaire est également situé aux joints de grains (Fig. 2e, k). Les échantillons modernes et fossiles montrent des profils de perte de poids globalement similaires, mais les courbes dérivées suggèrent des différences de décomposition. Les otolithes modernes se décomposent sur une plage de température plus large par rapport aux otolithes modernes (environ 200 à 430 ° C contre 250 à 400 ° C) et présentent plusieurs étapes de perte de poids (à environ 210 ° C, 360 ° C et 410 ° C) par rapport à la perte de poids relativement importante (à environ 340 ° C) dans les otolithes fossiles (Fig. S1 supplémentaire).

Similitude morphologique, microstructurale et cristallographique des otolithes sagittaux modernes de Phycis phycis (a–g) et fossiles de Phycis tenuis (h–n). Les sagittas modernes (a) et fossiles (h) sont minces et allongées ; la face externe (surface distale) est le plus souvent composée d'épaississements/protubérances irréguliers et de rainures. Les coupes minces en lumière transmise polarisée (b,c,i,j) et normale (d,k) montrent de nombreux cernes de croissance et indiquent une continuité ontogénétique des protubérances (colonnes en coupe longitudinale ; parfois séparées par des vides fusiformes, des flèches blanches ). Les images d'orientation cristallographique (EBSD) montrent des cristaux d'aragonite de taille similaire dans les échantillons modernes (e) et fossiles (l) (les cartes de phase (f, m) confirment la minéralogie de l'aragonite des deux échantillons) ; les figures polaires sont tout à fait comparables entre les échantillons modernes (g) et fossiles (n) : même taille de cristal, distribution, inclinaison, dispersion azimutale et distribution turbostratique dans le plan (222). ZPAL P.21/R-OTH-242/001 (a–g) ; ZPAL P.21/ C-OTH-07/006 (h–n). La palette BungeColorKey (plus accessible aux utilisateurs daltoniens) de MTEX ​​a été utilisée pour créer des images d'orientation et les figures de pôles.

Structure composite organo-minérale des otolithes sagittaux de Phycis phycis (a–f) et fossile de Phycis tenuis (g–l). Au FESEM, les fibres d'aragonite des otolithes modernes et fossiles sont constituées d'unités élancées ca. 200 à 300 nm de large (a, g) qui, à plus fort grossissement (b, h), montrent une organisation nanogranulaire ; nanograins env. 50 à 100 nm de diamètre sont visibles sur les images AFM en mode hauteur (c,i) et en mode erreur de force maximale (d,j). Les observations TEM des lamelles squelettiques (extraites par faisceau d'ions focalisé) montrent des fibres d'aragonite à petite échelle (de taille comparable à celles observées au FESEM) qui comprennent de nombreuses inclusions organiques (flèches en f,l). Fibres en (e) coupées obliquement ou longitudinalement (k) par rapport à la direction de croissance. ZPAL P.21/R-OTH-187/002 (a–f) ; ZPAL P.21/C-OTH-07/007 (g–l).

La racémisation des acides aminés et leur teneur relative dans les échantillons d'otolithes fossiles ont été utilisées comme indicateur de la dégradation des protéines. Les analyses ont été réalisées à partir d'otolithes fossiles de P. tenuis comparés directement à des P. phycis modernes. Les mesures comprenaient les acides aminés libres présents à l'origine dans les biominéraux (FAA) ainsi que ceux formés lors de l'hydrolyse de peptides complets en acides aminés individuels (appelés acides aminés hydrolysables totaux, THAA). Les FAA ont tendance à résulter de l'hydrolyse d'acides aminés N-terminaux hautement racémisés, de sorte que le rapport D/L des FAA devrait être supérieur à celui des THAA pour un acide aminé donné. Comme prévu, la distribution des acides aminés entre les pools d'acides aminés libres (FAA) et les acides aminés polymérisés (THAA-FAA ; en pmol d'acides aminés par mg d'otolithe de départ) montre que la plupart des acides aminés dans les spécimens modernes font partie de peptides intacts alors que la majorité des peptides fossiles se sont décomposés en acides aminés individuels. Une perte spectaculaire à la fois d'Asx et de Glx, qui comprennent les acides aminés acides aspartique et glutamique, ainsi que de Ser a été observée dans les spécimens fossiles (tableau 1).

Au total, des peptides pour 132 protéines spécifiques aux poissons et plusieurs isoformes ont été détectés dans les otolithes modernes de P. phycis (tableau supplémentaire S2), tandis que des peptides pour 11 protéines spécifiques aux poissons ont été trouvés dans les otolithes fossiles de P. tenuis (tableau 2, tableaux supplémentaires S3 –S5), qui est un rapport de retour comparable à celui des squelettes de coraux modernes vs fossiles (aragonite) 21,22. Des protéines ont été observées dans les deux fractions de solubilité acide dans tous les échantillons et GluC a amélioré la détection des protéines dans les échantillons modernes, mais seuls les peptides de digestion trypsique ont été détectés dans les échantillons fossiles (tableau supplémentaire S6). De plus, la désamidation de l'asparagine et de la glutamine et l'oxydation de la méthionine ont été détectées (tableau supplémentaire S6)23. Cinq des 11 protéines séquencées à partir d'otolithes fossiles représentent des protéines codées par des gènes exprimés dans l'oreille interne (c.-à-d. alpha-tectorine, bêta-tectorine, otolin-1-like, otogelin/otogelin-like et otogelin-like). Les six autres protéines sont présentes dans les otolithes de poissons modernes, mais ne sont pas spécifiques à la fonction de l'oreille interne. Les protéines trouvées dans les otolithes modernes mais pas dans les fossiles comprennent, par exemple, l'ouhérine, une protéine importante pour le développement et l'homéostasie de l'oreille interne. D'autres protéines d'otolithes modernes comprennent plusieurs types de collagènes, la contactine, la lipoprotéine liée aux récepteurs de faible densité, l'anhydrase carbonique qui interconvertit le CO2 et le bicarbonate (tableau supplémentaire S2).

L'une des caractéristiques les plus distinctes des biominéraux, y compris les carbonates, est qu'ils sont invariablement des composites organiques-minéraux dans lesquels les composants organiques, tels que les polysaccharides, les lipides et les protéines, sont incorporés/intégrés dans la phase minérale inorganique, formant une échelle méso à nanométrique. inclusions et réseaux intra- et intercristallins 24,25. Ces composants organiques participent au processus de formation biominérale à médiation physiologique. Parce que les profils protéomiques peuvent être liés aux ressources/expressions transcriptomiques, les études du protéome des structures biominérales modernes donnent un aperçu des mécanismes moléculaires de la biominéralisation. L'identification de protéines dans des structures biominérales fossiles suscite donc l'espoir d'accéder indirectement à des informations liées au génome en l'absence d'ADN préservé dans des fossiles bien plus anciens que ca. 2 Ma, l'âge au-delà duquel l'ADN ne survit généralement plus dans les archives fossiles 26,27.

De plus en plus, des données paléoprotéomiques ont été extraites de diverses structures biominérales fossiles 21,28,29,30,31. Cependant, à ce jour, aucune information paléoprotéomique n'existe à partir d'otolithes fossiles qui représentent les restes de poissons les plus abondants dans les dépôts mésozoïques et cénozoïques. Cette étude est le premier rapport sur l'identification des protéines dans les otolithes fossiles menée en comparaison directe avec le protéome des otolithes modernes congénères (merlus phycidés). La discussion suivante se concentre sur deux aspects clés : les critères structuraux des biominéraux fossiles qui préservent les informations paléoprotéomiques vierges et l'analyse comparative de la teneur en protéines dans les otolithes de merlus phycidés modernes et fossiles.

Le matériel fossile sélectionné pour cette étude provient de Korytnica, une localité bien connue pour la préservation exceptionnelle des biominéraux aragonitiques (voir aussi la section "Matériel")32,33. En effet, dans tous les échantillons d'otolithes fossiles étudiés ici, seul le polymorphe carbonate d'aragonite a été détecté ; c'est-à-dire que nous n'avons observé aucune preuve de la présence de calcite secondaire ou d'autres phases secondaires. La préservation exceptionnelle de ces otolithes fossiles est en outre étayée par leurs caractéristiques cristallographiques et ultrastructurales, qui ne se distinguent pas de celles caractérisant les homologues modernes en termes de distribution des tailles de cristaux, d'orientation/inclinaison, de dispersion azimutale et de distribution turbostratique (plan (222) (Figs. 1, 2). Une autre preuve de l'état de conservation extrêmement vierge de ces otolithes fossiles est fournie par la présence de leur texture nanogranulaire, typique des otolithes et de la plupart des autres minéraux biogéniques6,34,35. Les nanograins nodulaires (environ 100 nm de diamètre), qui sont généralement visualisés par microscopie à force atomique (Fig. 2c, d, i, j) sont considérés comme le produit d'un processus de biominéralisation impliquant des précurseurs amorphes 36, 37. Dans ce processus, les molécules organiques sont incorporées dans le biominéral cristallisant, par exemple, sous forme d'inclusions, et sous forme d '«enveloppes» riches en matières organiques autour des nanograins résultants (Fig. 2e, f, k, l) 25. Les protéines individuelles impliquées dans le processus de biominéralisation du carbonate ont des masses allant jusqu'à des centaines de kDa et des tailles de quelques à plusieurs nanomètres de diamètre/rayon de bobine aléatoire (protéines structurées/IDP). Leur encastrement dans la structure cristalline a été interprété comme l'apparition d'inclusions intra- et intercristallines38,39. De telles inclusions sont constamment présentes dans les échantillons d'otolithes modernes et fossiles analysés ici, et nous supposons qu'elles sont la principale source de matière protéique dans cette étude. Des analyses (paléo)protéomiques antérieures ont examiné la racémisation des acides aminés et leurs mesures de teneur relative pour évaluer le potentiel de conservation des échantillons40. La dégradation des protéines est clairement suggérée par la répartition des acides aminés entre les pools d'acides aminés libres (FAA) par rapport aux acides aminés polymérisés (THAA-FAA, en pmol d'acides aminés par mg de matériau d'otolithe de départ) ; la plupart des peptides fossiles se sont décomposés en acides aminés individuels. Le biais observé en faveur des acides aminés acides dans les spécimens fossiles suggère que les protéines hautement acides (communes aux biominéraux en général) font partie de portions plus solubles du biominéral, qui ont été préférentiellement dégradées ; cela se reflète dans les types de protéines séquencées par LC-MS/MS (tableau 2). La dégradation des protéines est également étayée par les données thermogravimétriques. Les thermogrammes des échantillons récents présentent une plage de décomposition thermique plus large et un nombre plus élevé d'étapes de perte de poids par rapport aux échantillons fossiles. Les échantillons récents contiennent des composés organiques qui diffèrent dans leur susceptibilité à la décomposition thermique, il n'est donc pas surprenant que la plage de température de leur décomposition soit relativement large. Il apparaît donc que les otolithes modernes contiennent une plus grande diversité de composants organiques (protéiques), qui se manifeste par une plus grande plage de décomposition thermique (nombre d'étapes de perte de poids) par rapport aux otolithes fossiles, pour lesquels la diversité organique est plus faible.

Plus de 130 protéines ont été identifiées dans les otolithes de Phycis phycis adulte moderne. Il s'agit notamment des otolins, des otogélines, des ushérines et d'une cochline, qui ont déjà été identifiées dans les otolithes41,42. Parmi les protéines d'otolithes modernes détectées, 11 ont également été observées dans les otolithes fossiles de P. tenuis. Il s'agit notamment de l'alpha et d'une bêta tectorine, de deux protéines de type otogéline, de type otolin-1 et d'une neuroserpine, qui ont toutes été suggérées comme étant directement impliquées dans la biominéralisation du carbonate de calcium. Nous avons également identifié dans les otolithes fossiles des protéines supplémentaires non détaillées auparavant dans les otolithes de poisson, telles que la collagénase ; transformer la protéine induisant le facteur de croissance b, facteur d'épissage; protéine de type 19 riche en arginine/sérine; les protéines de type protocadhérine FAT 4; et la thrombospondine. Toutes ces protéines supplémentaires, à l'exception du facteur d'épissage, ont des termes GO les désignant comme extracellulaires ou associées à une membrane. Plusieurs se lient au calcium et au moins une, la protocadhérine, a été détectée dans des carbonates biogéniques d'autres organismes43.

Il existe plusieurs raisons possibles pour lesquelles cette suite particulière de protéines précédemment établies comme protéines de matrice d'otolithes a été préservée dans les otolithes fossiles étudiés ici. La co-préservation de certaines protéines peut résulter de leurs interactions intimes lors de la biominéralisation. L'otogéline et les alpha tectorines sont nécessaires pour attacher la membrane de l'otolithe aux structures sensorielles de l'oreille44, et l'otogéline est cruciale dans le développement larvaire précoce de l'ensemencement initial de l'otolithe10. Les bêta-tectorines séquestrent probablement le calcium au fur et à mesure de la biominéralisation10 et peuvent polymériser avec l'otolin45, améliorant éventuellement leur co-préservation. De même, les alpha tectorines possèdent un domaine Nidogène N-terminal qui a été proposé pour lui permettre d'interagir également avec l'otolin46. Les protéines détectées dans les otolithes fossiles sont parmi les protéines les plus performantes dans les otolithes modernes (des scores plus élevés indiquent une correspondance plus fiable entre les scores combinés de tous les spectres de masse observés et les séquences d'acides aminés dans les protéines examinées), ce qui s'est avéré linéairement lié à abondance relative de protéines47. Enfin, certaines protéines avec des résidus acides qui fournissent un échafaudage organique pour la formation biominérale (par exemple, otolin-1 like48) sont fortement stabilisées par les ions calcium ; ces protéines peuvent adhérer fermement à la surface biominérale, ce qui peut améliorer leur potentiel de préservation dans les archives fossiles29.

Nos observations affinent les critères structurels pour une préservation exceptionnelle des biominéraux carbonatés dans les archives fossiles, et les séquences de paléoprotéines indiquent des processus de biominéralisation de l'oreille interne hautement conservés chez les poissons à travers les temps géologiques.

Des otolithes modernes de Forkbeard (Phycis phycis, famille des Phycidae) ont été prélevés sur des poissons capturés par des pêcheurs le long de la côte ouest portugaise continentale entre 2011 et 2012. tubes en plastique à la Faculté des Sciences de Lisbonne (Portugal) jusqu'aux analyses49,50. Deux grands spécimens de Phycis phycis ont été sélectionnés pour des analyses de structure biominérale (ZPAL P.21/R-OTH-242/001, ZPAL P.21/R-OTH-187/002) et trois spécimens (environ 2,5 g de poids) ont été sélectionnés pour l'analyse du protéome (ZPAL P.21/R-OTH-196/003, ZPAL P.21/R-OTH-197/004, ZPAL P.21/R-OTH-198/005).

Les échantillons fossiles d'otolithes sagittaux de P. tenuis ont été collectés dans les Argiles de Korytnica [position GPS : 50°39′50′′ à 50°40′50′′ N et 20°31′20′′ à 20°33′00′ ′ E; trois sites : Korytnica-Plebania, Korytnica-Forest et Mt. Lysa33], un faciès unique déposé dans la partie terminale de la baie (bassin de Korytnica) développé au Miocène le long de la côte rocheuse sur les versants sud des monts Sainte-Croix, Pologne centrale20. Le bassin de Korytnica est rempli par une séquence sédimentaire peu profonde composée d'env. Séquence d'argiles de 30 à 60 m d'épaisseur, interférant localement avec les bancs d'huîtres. L'âge absolu de la séquence de Korytnica est estimé à 14,8–14,6 Ma51,52 Les argiles de Korytnica sont renommées pour la préservation immaculée des fossiles du Miocène. Une telle préservation exceptionnelle est soutenue par la minéralogie de l'aragonite (un polymorphe de CaCO3 métastable dans des conditions normales) des squelettes, par exemple, des coraux scléractiniens, des gastéropodes et des otolithes de poissons et leurs caractéristiques micro- et nanostructurales distinctes et entièrement comparables aux homologues modernes6. Les conditions exceptionnellement favorables de fossilisation sont en outre étayées par des motifs de couleur résiduels exceptionnels de certaines coquilles de gastéropodes et de balanes20,53,54. Une telle préservation implique que les fossiles incrustés dans des argiles imperméables ont été pratiquement isolés de l'environnement extrême. Après le retrait des mers de Paratéthys de la périphérie sud des montagnes de la Sainte-Croix, ces sédiments n'étaient pas recouverts d'une couverture sédimentaire épaisse supplémentaire qui pourrait provoquer un effet de chaleur du gradient géothermique sur les matériaux fossiles. La température moyenne annuelle prédéfinie pour la région de Świętokrzyskie en Pologne varie de 5,61 ° C (en 1940) à 10,10 ° C (en 2019); observations de 1901 à 202155. Compte tenu de la nature à grain très fin des argiles de Korytnica et par conséquent, typique de ces sédiments, une conductivité thermique extrêmement faible56, il peut être fiable suggéré que les échantillons d'otolithes examinés (récupérés à partir de sédiments trouvés aujourd'hui à 1-2 m de profondeur ) n'ont pas connu de fluctuations de température significatives au cours de leur histoire d'inhumation.

Les échantillons d'argile ont été lavés et tamisés à travers des tamis standard (500/250/125 μm) et séchés à 40 °C. D'env. 300 spécimens d'otolithes de P. tenuis, 2 spécimens ont été sélectionnés pour des analyses de structure biominérale (ZPAL P.21/C-OTH-07/006, et ZPAL P.21/C-OTH-07/006) ; 20 spécimens (environ 1,6 g de poids) ont été sélectionnés pour l'analyse du protéome (numéro collectif ZPAL P.21/C-OTH-07/008-027). Les échantillons sélectionnés pour les analyses (paléo)protéomiques ont été trempés dans de l'hypochlorite de sodium (5%) pendant 3 h, rincés et passés aux ultrasons avec de l'eau déionisée et séchés à 40 ° C pendant la nuit.

Le matériel des otolithes modernes et fossiles est conservé à l'Institut de paléobiologie, Académie polonaise des sciences, Varsovie (abréviation ZPAL). Des informations détaillées sur l'identification des échantillons sont fournies dans le tableau supplémentaire S1.

Les caractéristiques structurelles de l'otolithe ont été étudiées et photographiées à l'aide d'un microscope à lumière transmise Nikon Eclipse 80i à l'Institut de paléobiologie, Académie polonaise des sciences, Microscopie électronique à balayage d'émission de champ (FESEM, Zeiss Merlin) au Département de chimie, Université de Varsovie, Thermo Microscope Fisher Tecnai Osiris au Centre de microscopie électronique (CIME) de l'Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), et Microscopie à Force Atomique (AFM) utilisant l'instrument Multimode 5 (Veeco) mis à niveau vers la version Multimode 8 (Bruker), au Département de chimie, Université de Varsovie. Des images au microscope optique (en lumière polarisée) ont été prises à partir de coupes ultra-fines (2 à 12 μm d'épaisseur) réalisées dans le plan sagittal de l'otolithe. Des images FE-SEM ont été prises de sections brisées transversales d'otolithes montées sur des talons avec du ruban adhésif double face et une pulvérisation enduite d'un film de platine conducteur ; la tension d'accélération était de 5 kV, la distance de travail de 4 à 6 mm. L'imagerie par microscopie à force atomique a été acquise en mode ScanAsyst à l'aide de porte-à-faux en silicone dédiés. Deux signaux (erreur de hauteur et de force maximale) ont été collectés simultanément lors de chaque balayage. Les coupes sagittales polies d'otolithes (suspension de polissage final Buehler Topol 3 avec une taille de particules de 0,25 µm) ont été rincées dans de l'eau Milli-Q, lavées dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 s, puis gravées avec une solution d'eau Milli-Q pendant 7 h. Les images ont été traitées avec le logiciel WSxM v5.0 Develop 10.2 de Nanotec57. Les échantillons pour la microscopie électronique transmise (TEM) ont été préparés sous forme de lamelles TEM en coupe extraites puis broyées à l'aide d'une machine à faisceau ionique focalisé Gemini NVision 40 à double faisceau. Les morceaux initiaux sont broyés avec des ions gallium à 30 kV, 6,5 nA puis amincis avec des courants plus faibles étape par étape jusqu'à utiliser 80 pA, et enfin lissés à 5 kV, 80 pA. Les analyses TEM ont été effectuées à une tension d'accélération de 200 kV. Des images à champ noir annulaire à angle élevé (HAADF) en mode microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) ont été enregistrées avec une taille de point de 0, 5 nm et une longueur de caméra de 115 mm.

L'échantillon de surface (des lames épaisses) a été poli avec de l'alumine de 1 µm, 0,3 µm et 0,05 µm et enfin poli avec de la silice colloïdale (0,05 µm). Avant l'analyse, les échantillons ont été recouverts d'une fine couche (environ 2 nm) de carbone à l'aide d'une coucheuse sous vide poussé. L'étude EBSD a été réalisée avec le détecteur Oxford NordlysMax monté sur un microscope électronique à balayage JEOL JSM-6610LV à l'Institut d'ingénierie des matériaux de l'Université de technologie de Łódź. Les données EBSD ont été collectées avec le logiciel AztecHKL à vide poussé, 20 kV, grand courant de sonde et 20 mm de distance de travail. Les motifs EBSD ont été collectés à une résolution de pas de 0,22 μm pour les cartes cristallographiques en utilisant les paramètres de cellule unitaire caractéristiques de l'aragonite et de la calcite comme suit58,59 : symétrie "Pmcn" et a = 4,96 Å, b = 7,97 Å et c = 5,75 Å estimée pour le corail Favia en utilisant la diffraction des rayons X sur poudre avec un rayonnement synchrotron (43) et a = b = 4,99 Å, et c = 17,06 Å, respectivement. Les données EBSD sont représentées dans cette étude par des cartes cristallographiques, des images de phase et les figures polaires, qui représentent la projection stéréographique des plans cristallographiques en référence aux plans d'aragonite (100), (010), (001) et (222). Les images d'orientation et les figures de pôles ont été créées à l'aide du plugin open source MTEX ​​pour le programme Matlab (https://mtex-toolbox.github.io/). Pour éliminer la combinaison de couleurs rouge et verte et créer des images plus accessibles aux utilisateurs daltoniens, nous avons sélectionné la palette BungeColorKey de MTEX ​​(le résultat a été testé à l'aide de Coblis, le simulateur de daltonisme sur https://www.color-blindness.com/coblis -simulateur de daltonisme/).

L'analyse thermogravimétrique a été réalisée avec un appareil TGA Q50 (TA Instruments) au Département de chimie de l'Université de Varsovie. Des échantillons d'otolithes (37,48 et 37,16 mg pour les échantillons fossiles et récents, respectivement) ont été chauffés dans un environnement d'azote sous gradient linéaire (10 °C min–1) de la température ambiante de 20 °C à 550 °C.

Le premier test de l'hypothèse selon laquelle la matière organique d'origine reste dans l'otolithe comprenait une analyse de racémisation des acides aminés (RAA)60,61. L'analyse AAR a fourni des informations sur le fait que les échantillons ont été nettoyés de manière appropriée (D/L des spécimens fossiles approchant (1), que le matériel protéique d'origine était toujours intégré (D/L des spécimens fossiles approchant (1), et a donné une idée de l'état de dégradation (c'est-à-dire que des concentrations relatives et une abondance d'acides aminés similaires à celles des échantillons d'otolithes modernes devraient suggérer une dégradation minimale).

Les acides aminés pour l'analyse de racémisation, les acides aminés hydrolysables libres et totaux, ont été extraits, hydrolysés et évaporés à sec à partir de poudres de squelette nettoyées (décrites ci-dessous) par des méthodes standard61. Tous les échantillons ont été préparés en double et analysés au laboratoire de géochronologie des acides aminés de la Northern Arizona University en utilisant des méthodes standard avec des modifications pour les microfossiles60,62. Les échantillons réhydratés ont été dopés avec de la L-homo-arginine comme étalon interne, puis injectés dans une HPLC équipée d'une colonne garnie de C18 en phase inverse. Des échantillons « vierges » ont été inclus. Nous avons précédemment montré que la mise en place de notre « espace propre » et le protocole de manipulation sont suffisants pour prévenir la contamination par des protéines exogènes dans le laboratoire21.

Les otolithes fossiles et modernes ont été réduits en poudre au mortier et au pilon à 125 μm, oxydés dans de l'eau de Javel concentrée 50:50/H2O2 pendant 1 h tout en sonicant selon les méthodes modifiées de Stoll et al.63, rincés cinq fois avec MilliQ et séchés. L'oxydation et les rinçages ont été répétés deux fois de plus. Des poudres nettoyées d'environ 0,5 g par échantillon ont été décalcifiées dans de l'acide acétique 0,5 M, toutes les manipulations ayant lieu dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination. La matrice organique soluble (SOM) a été concentrée par filtration centrifuge (Amicon, seuil de coupure de 3 kDa) et rincée avec une solution saline tamponnée au phosphate filtrée. La matrice organique insoluble (IOM; matériau qui s'est aggloméré à 43 000 x g pendant 5 min) a été lavée trois fois avec de l'acétone à 80 %. Les protéines fossiles ont été préparées sous forme d'échantillons uniques pour chaque fraction de solubilité (échantillon 07) ; les échantillons modernes ont été extraits en triplicatas biologiques (échantillons 196–198). Les échantillons ont été solubilisés dans un tampon SDS puis digérés en utilisant le protocole MED-FASP sur une unité centrifuge Microcon de 30 kDa (Sigma Aldrich) après avoir rincé le tampon SDS avec 8 M d'urée 64 par des applications séquentielles de trypsine puis d'enzymes Glu-C. Les échantillons ont été séquencés par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) à l'UCLA Semel Institute Proteomics Facility. Chaque fraction a été analysée séparément sur un système de chromatographie nano-liquide couplé à un spectromètre de masse orbitrap haute résolution de paillasse (QE-Plus; Thermo Fisher) et fonctionné en mode ions positifs avec acquisition dépendante des données. MS1 a été réalisée à une résolution de 70 000 (à 400 m/z) et MS2 à 17 500. Des blancs instrumentaux ont été exécutés entre tous les échantillons pour minimiser le report. Les spectres de masse transformés ont été analysés dans Mascot par rapport à la base de données UniProt-Human, une base de données commune sur les contaminants, et la base de données des 65 protéines prédites du génome Phycis phycis. La base de données de protéines P. phycis (tableau supplémentaire S5) a été générée à l'aide du pipeline BRAKER, qui comprend l'utilisation des programmes GeneMark-ES/ET et Augustus66,67,68,69, pour prédire les régions codant pour les protéines du P. génome de phycis. La base de données sur les protéines prédites de la morue franche (Gadus morhua) (assemblage NCBI GCA_902167405.1 gadMor3.0) (fichier de protéines prédites disponible) a été utilisée pour saisir des "indices" afin de guider la prédiction CDS. Tous les échantillons ont permis une modification fixe de la carbamidométhylation sur C et une oxydation variable sur MW, une désamidation sur NQ et une acétylation N-terminale des protéines ; des échantillons de fossiles ont également permis Phospho K & T et MOD. Pour chaque échantillon, une première recherche de leurre a été effectuée pour déterminer les valeurs de p pour un taux de fausse découverte de 1 %. Ensuite, une recherche tolérante aux erreurs a été effectuée, avec la valeur de p ajustée si nécessaire. Les scores seuils ont été appliqués à la valeur recommandée par l'algorithme Mascot. Les séquences renvoyées ont été annotées dans le logiciel Blast2GO et exécutées dans Blast2GO par rapport à la base de données NCBI nr primates pour tester les contaminants humains potentiels non détectés par la base de données UniProt-Human à Mascot ; les protéines humaines contaminantes probables ont été exclues de la liste finale si elles étaient > 90 % similaires aux primates avec une valeur e inférieure à 20 unités de l'annotation d'origine, inférieure à 10 unités de valeur e et 10 % de similarité pour e-50 et moins, ou dans les 5 unités de valeur e et 10 % de similarité pour e-50 et plus22. Les séquences en double ont été vérifiées dans CD-HIT avec > 90 % de similarité ; les doublons sont notés séparément mais comptés ensemble dans le nombre total de protéines. Plusieurs protéines ont été prédites en tant que peptides séparés ; ces peptides ont été BLASTés contre le protéome prédit de la morue atlantique (Gadus morhua) (assemblage NCBI GCA_902167405.1 gadMor3.0) et concaténés, avec des chaînes de XX indiquant des régions de séquence inconnue entre des peptides connus.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses informations supplémentaires). Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Proteomic Xchange Consortium via le référentiel partenaire Pride70 (https://www.ebi.ac.uk/pride/login) sous l'identifiant de l'ensemble de données PXD036742 et https://doi.org/10.6019 /PXD036742. Aucune approbation ou orientation éthique n'était requise car cette étude n'a analysé que des spécimens prélevés sur les débarquements commerciaux de navires de pêche et des matériaux fossiles dans les collections de musées.

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Ce travail a été soutenu par les subventions de recherche du National Science Center (Pologne) 2017/25/B/ST10/02221 et 2020/39/B/ST10/01253 à JS, NSF Postdoctoral Research Fellowship in Biology award #1611943 et Zuckerman STEM postdoctoral leadership fellowship à JD, et la bourse du Fonds national suisse de la recherche scientifique 205321_212614 à AM. ARV a été soutenu par la Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, Portugal) dans le cadre du contrat de recherche CEECIND/01528/2017. Nous remercions T. Bernat, le laboratoire de géochronologie des acides aminés de la Northern Arizona University et le laboratoire de protéomique du NPI-Semel Institute de l'UCLA pour le traitement des échantillons, l'analyse des acides aminés et des protéines, respectivement.

Institut de paléobiologie, Académie polonaise des sciences, Twarda 51/55, 00818, Varsovie, Pologne

Jarosław Stolarski

Département des sciences de la Terre, des planètes et de l'espace, Université de Californie, Los Angeles, Californie, États-Unis

Jean Drake

Faculté des sciences biologiques et environnementales, Universidad de León, Campus de Vegazana S/N, 24171, Leon, Espagne

Ismaël Coronado

Département de biologie animale, Faculté des sciences, Université de Lisbonne, Campo Grande, 1749-016, Lisbonne, Portugal

Ana R. Vieira

Centre des sciences marines et environnementales (MARE), Université de Lisbonne, Campo Grande, 1749-016, Lisbonne, Portugal

Ana R. Vieira

Département de géologie, Université de Varsovie, Żwirki i Wigury 93, 02089, Varsovie, Pologne

Urszula Radwanska

Département de biologie intégrative, Michigan State University, East Lansing, MI, États-Unis

Elizabeth AC Heath-Heckman

Département de chimie, Université de Varsovie, Pasteura 1, 02-093, Varsovie, Pologne

Maciej Mazur

École des sciences et de l'ingénierie des matériaux, Université du Hubei, Wuhan, 430062, Hubei, Chine

Guo Jinming

Laboratoire de Géochimie Biologique, Ecole d'Architecture, Génie Civil et Environnemental, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 1015, Lausanne, Suisse

Anders Meibom

Centre d'analyse avancée des surfaces, Institut des sciences de la Terre, Université de Lausanne, 1015, Lausanne, Suisse

Anders Meibom

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JS et JD ont conçu l'étude, analysé les données et rédigé le manuscrit. ARV et UR ont fourni et identifié du matériel d'otolithes modernes et de certains fossiles. IC a réalisé des cartes EBSD et interprété des mesures cristallographiques. MM a réalisé des images AFM et des analyses thermogravimétriques. EACH a effectué la prédiction de la protéine P. phycis à l'aide de BRAKER. GJ a fait des analyses TEM. JS, JD, IC, EACH, GJ, AM ont contribué à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit.

La correspondance est Jarosław Stolarski.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Stolarski, J., Drake, J., Coronado, I. et al. Première étude paléoprotéomique des otolithes de poissons fossiles et préservation à l'état pur de l'hôte cristallin biominéral. Sci Rep 13, 3822 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30537-8

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Reçu : 09 novembre 2022

Accepté : 24 février 2023

Publié: 07 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30537-8

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